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TOP10感受态细胞 说明书
点击次数:86      发布时间:2019-10-07

TOP10 Electro
TOP10 Electroporation-Competent Cell
产品规格:

TOP1 Electroporation-Competent Cel50μl×5
pUC19 (control vector, 10pg/μl)10μl

TOP10 电转化感受态细胞基因型:

F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80 lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araΔ139Δ(ara-leu)7697 galU  galK

rpsL (Strr)endA1 nupG

TOP10 电转化感受态简要说明:

TOP10 电击感受态细胞只能用于电击转化,不能用于热激转化。-CMbio-

TOP10 来源于 MC1061 菌株,是目前实验室最常用的感受态细胞之一,基因型与 DH10B 高度类似 (DH10B 为 galE15 型,而 TOP10 为 galU 型)。TOP10 生长速度快 (比 DH5α快,但比 Mach1-T1 生长速度慢),10 小时可见克隆。recA1 和 endA1 的突变有利于插入 DNA 的稳定和高纯度质粒 DNA 的提取。可用于构建克隆,蓝白斑筛选等实验,具有链 霉素抗性。-CMbio-

  1. -CMbio-TOP10 电击感受态细胞经特殊工艺制作,pUC19 质粒检测转化效率可达 1×1010 cfu/μg DNA


TOP10 电转化感受态操作说明:

1. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上 5 分钟,待其沥干水分,正置 5 分钟,使乙 醇充分挥

发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面 0.5 cm 以方便盖上杯盖,冰中 静置 5 分钟充分降温。

2. 取-80℃保存的 TOP10 电击感受态细胞插入冰中 5 分钟,待其融化,加入目的 DNA (质粒或连接产物) 并用手 EP 管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。-CMbio-
A. 测定转化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的对照质粒  pUC19;-CMbio-

B. 对于连接产物,请用乙醇沉淀 DNA 后加入适量 TE 缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重 悬,DNA 浓 度不超过 100 ng/μl,体积不超过 5 μl/50 μl 感受态。-CMbio-
3. 用 200 μl 枪头(用刀切除 0.5cm 枪尖)将感受态-DNA 混合物快速移到电击杯中,避免产生气泡,盖上杯盖。

4. 启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此为 BioRad 电转仪推荐参数,也可按所用 电转仪 推荐的参数操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中。-CMbio-
5. 2 分钟后从冰中取出电击杯,放室温,加入 1ml 不含抗生素的无菌 S.O.C. 培养基(室温),用 1ml 枪吹吸电击杯 底部数次混匀后,转移到 50 ml 离心管(BD Falcon 50 ml 锥形离心管等),向离心管中 补加 S.O.C. 培养基至 10 ml。 倾斜 45 度放入摇床,37℃,225 rpm 复苏 60 分钟。-CMbio-
6。 5000 rpm 离心一分钟收菌,重悬后取 100-200 μl 涂布到含相应抗生素的 S.O.C 平板上(因菌量较大, 若全部涂 板请选用直径 15cm 培养皿 2-5 个)。将平板倒置放于 37℃培养箱过夜培养 13-17 小时。-CMbio

TOP10 电转化感受态注意事项:
1.  加入 DNA 时体积不应大于感受态体积的 1/10。 -CMbio-

2. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡,气泡会增加弧光放电风险。-CMbio-

3. 当 DNA 不纯或存在盐,乙醇,蛋白及缓冲液等污染时,转化效率急剧下降。-CMbio-

4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导,增大在含有细胞和 DNA 的溶液中产生电流和弧光放电的风险。

5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率,推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍,转化效率下降一个 数量级。-CMbio-
6. 对于连接产物转化,转化前乙醇沉淀 DNA 后用适量 TE 缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产 物,保证 DNA 浓度不超过 100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率,增加弧光放电的风险。 7。 混入质粒时应轻柔操作,吸取感受态细胞时避免用力过猛,以免剪切力过大损伤细胞膜,降低转化效率。转化高浓


度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。-CMbio-

8。 电击感受态细胞保存在-80℃以下,高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。-CMbio-

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